|
|
Substrate specificity, mechanism and activity regulation of the rhomboid family intramembrane proteases
Škerle, Jan
Intramembránové proteasy z rodiny rhomboidů jsou v přírodě široce rozšířeny a vyskytují se ve všech doménách života. Podílejí se na mnoha důležitých procesech, jako například kontrola kvality membránových proteinů nebo mitochondriální dynamika. Jejich aktivita souvisí s nemocemi jako Parkinsonova nemoc nebo rakovina. Proto se rhomboidy jeví jako potenciální terapeutické cíle. V této práci jsme se snažili objasnit detailní mechanismus fungování modelové proteasy GlpG z E. coli. Zaměřili jsme se i na mechanismus rhomboidu RHBDL2, což je jeden ze čtyř eukaryotických rhomboidů, jejichž funkce není příliš prostudována. Pro pochopení vazby mezi substrátem a enzymem jsme připravili řadu nových peptidyl-chlormethylketonových inhibitorů odvozených od proteinu TatA, což je substrát rhomboidu v P. stuartii. Díky krystalové struktuře komplexů GlpG s těmito inhibitory jsme prozkoumali vazebná místa substrátu S1 až S4, což nám umožnilo objasnit strukturní podstatu substrátové specifity enzymu. Ukázali jsme, že rychlost štěpení substrátu může být významně ovlivněna modifikací sekvence substrátu na pozicích P1 až P5. Na základě těchto pozorování jsme vyvinuli fluorogenní transmembránový peptidový substrát rhomboidových proteas, který je použitelný jak v detergentu, tak v liposomech, a je vhodný pro testování s...
|
|
|
Substrate specificity, mechanism and activity regulation of the rhomboid family intramembrane proteases
Škerle, Jan ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Intramembránové proteasy z rodiny rhomboidů jsou v přírodě široce rozšířeny a vyskytují se ve všech doménách života. Podílejí se na mnoha důležitých procesech, jako například kontrola kvality membránových proteinů nebo mitochondriální dynamika. Jejich aktivita souvisí s nemocemi jako Parkinsonova nemoc nebo rakovina. Proto se rhomboidy jeví jako potenciální terapeutické cíle. V této práci jsme se snažili objasnit detailní mechanismus fungování modelové proteasy GlpG z E. coli. Zaměřili jsme se i na mechanismus rhomboidu RHBDL2, což je jeden ze čtyř eukaryotických rhomboidů, jejichž funkce není příliš prostudována. Pro pochopení vazby mezi substrátem a enzymem jsme připravili řadu nových peptidyl-chlormethylketonových inhibitorů odvozených od proteinu TatA, což je substrát rhomboidu v P. stuartii. Díky krystalové struktuře komplexů GlpG s těmito inhibitory jsme prozkoumali vazebná místa substrátu S1 až S4, což nám umožnilo objasnit strukturní podstatu substrátové specifity enzymu. Ukázali jsme, že rychlost štěpení substrátu může být významně ovlivněna modifikací sekvence substrátu na pozicích P1 až P5. Na základě těchto pozorování jsme vyvinuli fluorogenní transmembránový peptidový substrát rhomboidových proteas, který je použitelný jak v detergentu, tak v liposomech, a je vhodný pro testování s...
|
|
|
Význam S1 podmísta intramembránových proteas z rodiny rhomboidů pro katalýzu a návrh inhibitorů
Kučerová, Jolana ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá vývojem specifických inhibitorů intramembránových proteas z rodiny rhomboidů. Tyto inhibitory jsou potřebné pro buněčně biologické studium rhomboidových proteas i jejich potenciální farmakologické zacílení. Intramembránové proteasy z rodiny rhomboidů jsou spojovány s různými onemocněními, jako například malárií, Parkinsonovou chorobou, rakovinou, či toxoplazmózou. Laboratoř školitele nedávno objevila první skupinu takovýchto inhibitorů, peptidyl ketoamidy. Pro jejich plné využití je nutné vlastnosti a možnosti modifikace těchto látek blíže prozkoumat. Cílem této práce bylo prostřednictvím syntetických fluorogenních substrátů a enzymové kinetiky ověřit možnosti využití S1 podmísta v aktivním místě rhomboidu pro návrh inhibitorů se zvýšenou účinností a selektivitou, a také pomocí variant substrátů se záměnami v P1 pozici za nepřirozené aminokyseliny prozkoumat mechanismus transferu vody do aktivního místa rhomboidové proteasy. Ze srovnání rychlosti štěpení deseti fluorogenních substrátů s modifikací v P1 pozici rhomboidem GlpG z E. coli bylo zjištěno, že nejlépe přijímané postranní řetězce aminokyselin v P1 pozici (vážící se do S1 podmísta) jsou pro GlpG -CH2-CH3 a -CH3. Tento trend se potvrdil i u peptidyl ketoamidových inhibitorů. Ze studia substrátů a inhibitorů...
|
|
|
Analysis of substrate specificity and mechanism of GlpG, an intramembrane protease of the rhomboid family.
Peclinovská, Lucie ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent)
Proteiny z rodiny rhomboidů jsou široce konservované v evoluci a obsahují dvě velké podskupiny, proteolyticky aktivní intramembránové proteasy serinového typu (rhomboidy) a rhomboidům podobné proteiny, které během evoluce ztratily proteolytickou aktivitu, ale zachovaly si schopnost vázat membránový helix jiných proteinů. Zástupci obou těchto skupin hrají významnou roli v celé řadě biologických procesů, jako například v buněčné signalizaci, v mechanismech podílejících se na kontrole kvality sbalení proteinů v endoplasmatickém retikulu, v mitochondriální dynamice a také v hojení ran. Ačkoliv medicinský potenciál proteinů z rodiny rhomobidů vzrůstá, pochopení strukturní podstaty jejich funkce pokulhává. Hlavním strukturním a mechanistickým modelem pro pro rodinu rhomboidů a vlastně pro intramembránové proteasy obecně se stal rhomboid GlpG z E.coli, který byl první intramembránovou proteasou jejíž rentgenová struktura byla vyřešena. Substráty GlpG jsou membránové proteiny s jedním transmembránovým helixem a ke štěpení dochází v jejich transmembránové části, ale mechanismus vazby substrátu na enzym ani podstata substrátové specifity nejsou plně pochopeny. Tato práce se zabývá charakterizací významu transmembránové domény substrátu pro jeho rozpoznání proteasou GlpG a využívá hlavně enzymové kinetiky a...
|
host ::
RSS.